Výzkumná skupina Michala Masaříka
Výzkumná skupina Michala Masaříka je biomedicínská výzkumná laboratoř specializující se na buněčnou biologii v kontextu nádorových onemocnění. Zaměřujeme se na pochopení složitosti nádorového mikroprostředí, zejména mechanismů, které jsou základem rezistence na léčbu a agresivity nádorových buněk. Projekty zahrnují jak základní, tak translační výzkum, který aplikuje poznatky na klinickou diagnostiku, patofyziologii a léčbu nádorových onemocnění. K dosažení těchto cílů strategicky spolupracujeme s národními a mezinárodními výzkumnými ústavy, klinickými pracovišti a specializovanými společnostmi v oblasti preklinické farmakologie a biotechnologií.
Výzkumná témata
Cílení na mitochondrie za účelem inhibice migrace nádorových buněk
Mitochondrie slouží jako primární generátory energie a základních stavebních prvků, které jsou klíčové pro růst a funkci buněk. Dlouholetá představa, že mitochondrie se nepodílejí na růstu nádorů, byla v posledních letech vyvrácena, což souvisí s uznáním mitochondrií jako slibných cílů pro terapeutické ovlivnění v protinádorové léčbě. Tyto organely vykazují v nádorových buňkách odlišné vlastnosti ve srovnání s nenádorovými protějšky, což z nich činí selektivní cíle pro spektrum protinádorových látek, které přesahují úlohu těchto organel pro tvorbu ATP.
Výsledky našeho výzkumu podtrhují účinnost některých sloučenin, jako jsou pentamethiniové soli, které vykazují specifickou afinitu k vnitřním mitochondriálním membránám. Pentamethiniové soli silně potlačují migraci nádorových buněk, čímž ovlivňují metastatické šíření. Aktivně zkoumáme sloučeniny slibné pro strategii "migrastatické" léčby s konečným cílem identifikovat klinicky relevantní protinádorové látky.
Metabolická symbióza v nádorovém mikroprostředí
Metabolické fenotypy nádorových buněk jsou heterogenní a flexibilní, protože nádorová masa je rychle se vyvíjející systém, který se dokáže neustále přizpůsobovat dostupnosti kyslíku a živin. Kromě toho je pro metastatické šíření nutné zvýšení produkce ATP buňkami. Změny v intracelulární hladině ATP/ADP přímo souvisejí s rychlostí migrace buněk.
Povaha nádorového metabolismu je dána kombinací účinků faktorů vlastních nádorovým buňkám a faktorů poskytovaných nádorovým mikroprostředím prostřednictvím onkogenní metabolické symbiózy. Pochopení toho, jak onkogenní metabolická symbióza vzniká a vyvíjí se, má zásadní význam pro pochopení tumorigeneze.
Úloha fibroblastů asociovaných s nádory
V naší laboratoři se zaměřujeme na proces, kterým nádorové buňky přeprogramovávají své mikroprostředí (TME), včetně změn v mezibuněčné komunikaci a změn metabolického fenotypu buněk TME. Fibroblasty jsou základní složkou TME a odrážejí stres v TME. Takové stresové reakce fibroblastů mohou zahrnovat jejich aktivaci na fibroblasty spojené s nádory (CAF). Pleiotropní účinek CAFs v TME pravděpodobně odráží heterogenitu a plasticitu jejich populace s kontextově závislými účinky na karcinogenezi. CAFs poskytují mnoho cílových molekul, které by mohly hrát důležitou roli v budoucí terapii nádorů.
Role mikrobiomu
TME je komplexní prostředí, které zahrnuje nejen lidské buňky, ale také společenství mikroorganismů známé jako mikrobiom, včetně virů, mykoplazmat, bakterií, archeí a bakteriofágů. Lidský mikrobiom je složitý ekosystém, který úzce spolupracuje s lidským hostitelem. Zbytky těchto mikrobů, jako jsou DNA, RNA, peptidy a složky buněčné stěny, byly zjištěny v nádorových buňkách a v imunitních buňkách infiltrujících nádory. Toto zjištění naznačuje, že mikrobiální prvky mohou přímo interagovat s buněčným mechanismem nádorových buněk i buněk TME a potenciálně ovlivňovat jejich chování a funkce. Zaměřujeme se na zkoumání komplexní souhry mezi genetikou a faktory prostředí zprostředkované mikrobiomem u heterogenních nádorů, které postrádají silné řídící mutace s vysokou penetrancí.
Fosfatidylserin-pozitivní extracelulární vezikuly v buněčné komunikaci
Extracelulární vezikuly (EV) jsou membránové vezikuly uvolňované buňkami do extracelulárního prostoru a hrají důležitou roli v komunikaci mezi buňkami a regulaci mnoha biologických procesů. Podobně jako u apoptotických buněk je hlavním typem EV uvolňovaných nádorovými buňkami a CAF na jejich vnější membránové vrstvě fosfatidylserin (PS). Fosfatidylserin pozitivní EV (PS+EV) mohou připravit podmínky pro růst nádoru a vytvořit vhodné mikroprostředí. Tyto vezikuly mohou nejen podporovat proliferaci a metastazování nádorových buněk, ale také usnadňovat rezistenci nádorových buněk vůči lékům a dokonce organizovat vzájemné působení mezi nádory a sousedními buňkami, jako jsou fibroblasty asociované s nádorem (CAF).
Náš výzkum se zaměřuje na změny obsahu proteinů a RNA v PS+EV izolovaných z buněk CAF z dlaždicobuněčných nádorů v oblasti hlavy a krku (HNSCC) za normálních a stresových podmínek (např. lysozomální dysfunkce, hladovění). Zkoumáme také vliv těchto EV na biologickou odpověď recipientních nádorových buněk, jako jsou metabolické změny, migrace nebo citlivost na buněčnou smrt, během vzájemného ovlivňování mezi nádorovými buňkami a CAF. Cílem naší práce je lépe porozumět úloze PS+EV v mezibuněčné komunikaci v mikroprostředí nádorů a identifikovat potenciální biomarkery indikující procesy podílející se na progresi nádoru.
Jsme členy Mezinárodní společnosti pro extracelulární vezikuly (ISEV) a spoluzakladateli České společnosti pro extracelulární vezikuly (CzeSEV).
Buněčná mechanika
Mechanické vlastnosti buněk jsou ovlivněny buněčným cyklem, diferenciací a souvisejí s patologickými procesy, jako je maligní transformace, kardiovaskulární onemocnění nebo stárnutí. Schopnost nádorových buněk deformovat se souvisí se schopností šířit se v organismu - většina nádorových buněk je obvykle deformovatelnější než jejich nenádorové protějšky. Ačkoli jsou hlavní determinanty mechanických vlastností buněk známy, v mechanobiologii stále zůstává řada nezodpovězených otázek – například jak vnitrobuněčné uspořádání cytoskeletu a buněčný metabolismus a změny těchto parametrů souvisejí se schopností buněk migrovat a invadovat. Na tuto otázku se v naší laboratoři zaměřujeme s dlouhodobým cílem identifikovat klinický význam těchto změn. Za tímto účelem také vyvíjíme metodické přístupy ke kvantifikaci viskoelasticity buněk pomocí kvantitativní fázové mikroskopie, kdy jsme schopni měřit stovky buněk za minutu, což je řádově více než u konvenčních technik, jako je mikroskopie atomárních sil.
Metody
Kromě spektra běžných experimentů zaměřených na buněčnou biologii v laboratoři používáme následující techniky.
Kvantitativní fázové zobrazování
Kvantitativní fázové zobrazování, mikroskopická technika, nabízí cenné poznatky o buněčné dynamice tím, že umožňuje kvantitativní měření změn světelné fáze v živých buňkách. Tento neinvazivní přístup umožňuje přesné “label-free” časosběrné stanovení suché buněčné hmoty nebo indexu lomu, a tím charakterizaci buněčných procesů, jako je buněčný růst, či odpověď buněk na léčbu. Tyto změny lze pozorovat bez fixace a značení, které mění vlastnosti buněk, protože fluorescenční značení může ovlivnit chování buněk během dlouhých experimentů v důsledku fototoxicity.
Tuto techniku používáme pro charakterizaci analýzy růstu a migrace populací buněk, pro analýzu biofyzikálních vlastností buněk a pro kvantifikaci podprogramů buněčné smrti.
Izolace extracelulárních vezikul a funkční studie
Úspěšně jsme optimalizovali metodiku izolace extracelulárních vezikul, jejich charakterizaci a testování jejich účinku na recipientní buňky. Můžeme izolovat EV jak z kondicionovaných médií, tak z různých tělních tekutin, jako je krevní sérum.
Primární kultury odvozené od pacientů a xenografty odvozené od pacientů
Ve srovnání se stabilními buněčnými liniemi můžeme ze vzorků nádorové tkáně izolovat primární kultury nádorových i stromálních buněk a získat tak neocenitelné související informace o prognóze pacienta pro každou kulturu. V naší laboratoři tyto přístupy hojně využíváme k charakterizaci transkriptomu nádorových buněk a k propagaci různých subklonů, zejména nádorově asociovaných fibroblastů, což nám umožňuje sledovat in vitro, jak CAF odvozené od konkrétních pacientů ovlivňují chování nádorových buněk.
In vivo modely
V naší laboratoři provádíme in vivo experimenty modelových organismech, abychom prozkoumali různé aspekty nádorové biologie, účinky terapeutických zásahů a toxicitu nových protinádorových látek. Využíváme ortotopické i heterotopické aplikace pro studium růstu nádoru a šíření metastáz. Klíčovým zaměřením našich experimentů in vivo je analýza plicních metastatických ložisek, která poskytuje poznatky o metastazování nádorů a terapeutické účinnosti. Kromě toho využíváme tyto modelové organismy k hodnocení toxicity a účinnosti nových protinádorových sloučenin.
Chicken chorioallantoic membránová assay
Provádíme chicken chorioallantoic membrane (CAM) assay, která je mezistupněm mezi experimenty in vitro a in vivo, a to jak na platformě in ovo, tak ex ovo. V této assai můžeme pracovat s buněčnými liniemi nebo xenografty odvozenými od pacientů (PDX) a provádět testy angiogeneze. CAM používáme k hodnocení terapeutických zásahů, vlivu na metastatický potenciál nádorových buněk, toxicity nových protinádorových látek nebo k ovlivnění tvorby cév.
Umělá inteligence ve zpracování obrazu a analýze dat
V souladu se získáváním mikroskopických obrazových dat využívá naše laboratoř umělou inteligenci (AI) pro pokročilou analýzu buněčných obrazů. Tento přístup založený na umělé inteligenci automatizuje segmentaci a analýzu buněčných obrazů, čímž výrazně zvyšuje efektivitu a přesnost. S využitím strojového učení a AI můžeme přesně identifikovat a sledovat buněčné vlastnosti, což zefektivňuje studium buněčného růstu, migrace a reakce na léčbu. Tato metoda umožňuje analyzovat velké objemy dat a poskytuje vhled do buněčné dynamiky bez nutnosti časově náročných manuálních kroků během analýzy.
Tyto přístupy řízené umělou inteligencí kombinujeme s tradičními metodami analýzy pro různé typy dat včetně obrazů z konfokálního mikroskopu a kvantitativního fázového zobrazování. To nám umožňuje automatizovat rozpoznávání typů buněčné smrti, extrakci mechanických vlastností, automatickou analýzu reakce na léčbu a různé další aplikace.
Naše laboratoř vyvinula metodu založenou na kvantitativním fázovém zobrazování, která umožňuje detekovat buněčnou smrt a určit její specifický podtyp (apoptóza nebo lytická buněčná smrt) bez použití barviv, pouze na základě kvantitativní dynamiky fáze buňky.